J Neurosci︱李韶/麻彤辉团队揭示水通道蛋白点突变解聚小鼠AQP4正交列阵结构并降低其在星形胶质细胞终足处的极性分布

撰文︱朱丹丹，黄玥琳，李韶，麻彤辉

责编︱王思珍

编辑︱杨彬薇

AQP4（aquaporin-4）是一种在中枢神经系统高表达的水通道蛋白亚型，主要极性分布于血-脑屏障处星形胶质细胞终足，并且在各种因素引起的细胞性脑水肿形成中发挥重要作用[1-3]。AQP4与水通道家族中其它亚型的区别在于其在四聚体基本结构的基础上在细胞膜上形成正交列阵结构（orthogonal arrays of particles, OAPs），而OAP结构的形成主要涉及AQP4基因5’端不同剪切形式产生的两种主要亚型：M1和M23[1, 4]。OAP结构由M23形成，星形胶质细胞可以通过改变M1与M23的比例调节OAP结构的大小从而满足其迁移、细胞粘附、极化等不同功能需求[5]。推测OAP结构可能决定AQP4在血-脑屏障处星形胶质细胞终足的极性分布。有研究者试图通过选择性敲除M23-AQP4亚型构建一种“OAP-null”小鼠模型验证这一假设，结果发现星形胶质细胞中AQP4表达大幅下降90%，未能说明OAP结构在AQP4极性表达中的作用[6]。大连医科大学李韶课题组基于M23-A25Q点突变可使OAP形成降低~80%的前期报导，建立了AQP4-A25Q基因敲入小鼠模型，证实了OAP结构是决定AQP4在血-脑屏障处星形胶质细胞终足极性分布的关键因素。

2022年9月13日，大连医科大学基础医学院李韶、麻彤辉教授在神经科学权威期刊Journal of Neuroscience在线发表了题为“AQP4-A25Q Point Mutation in Mice Depolymerizes Orthogonal Arrays of Particles and Decreases Polarized Expression of AQP4 Protein in Astrocytic Endfeet at the Blood-Brain Barrier”的研究论文。该项研究首次发现AQP4^A25Q/A25Q小鼠大脑中AQP4 OAP结构显著减少，AQP4在构成血脑屏障的星形胶质细胞终足处表达显著降低，而AQP4总体mRNA和蛋白质表达无明显变化。该AQP4^A25Q/A25Q突变小鼠水中毒和大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)引起的脑水肿显著减轻。（拓展阅读：李韶团队最新研究成果，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Aging Cell︱李韶/马全红团队揭示Nav1.6在阿尔茨海默症中的作用及其机制）

首先，该研究团队构建了AQP4中第25位丙氨酸→谷氨酰胺突变（A25Q）的转基因敲入小鼠模型，并首次证明了AQP4-OAP的形成在构成血脑屏障的星形胶质细胞终足处极化表达的关键作用。通过比较AQP4^+/+和AQP4^A25Q/A25Q小鼠脑组织AQP4的mRNA和蛋白质的表达水平，以及通过BN-PAGE非变性胶电泳分析AQP4的OAP结构，采用可特异性识别由AQP4-M23亚型形成的OAP结构的视神经脊髓炎（NMO）患者血清IgG对AQP4^+/+和AQP4^A25Q/A25Q小鼠脑片进行免疫荧光染色，观察AQP4在构成血脑屏障的星形胶质细胞终足处的分布情况。结果表明AQP4-A25Q突变不影响总体AQP4 mRNA和蛋白表达，但却显著降低了OAP结构表达和构成血脑屏障的星形胶质细胞终足处AQP4蛋白的极化分布（图1）。

图1  A25Q突变对AQP4^A25Q/A25Q小鼠脑内AQP4表达和OAP形成的影响

（图源：Zhu DD, et al., J Neurosci, 2022）

为进一步观察AQP4-A25Q基因突变小鼠AQP4的超微分子结构，研究者采用g-STED超高分辨显微镜评估构成血脑屏障周围的星形胶质细胞终足处的AQP4分布。这项技术可以在纳米级分辨率确定单个AQP4 (OAPs)的大小和分布[6]。他们发现与AQP4^+/+相比AQP4^A25Q/A25Q小鼠血管周围星形胶质细胞终足处的AQP4 OAPs结构明显减少，且经过定量分析后发现AQP4^A25Q/A25Q小鼠的平均OAP大小比AQP4^+/+小鼠小3.5倍。OAP大小分布也不同，在AQP4^A25Q/A25Q小鼠中平均测量291.7±14.6 nm²，在AQP4^+/+小鼠中平均为998.7±50.0 nm²（图2）。这表明AQP4^A25Q/A25Q小鼠脑组织的AQP4 OAP结构发生解聚。

图2  AQP4-A25Q突变调节AQP4的超分子聚集

（图源：Zhu DD, et al., J Neurosci, 2022）

为进一步明确AQP4在AQP4^A25Q/A25Q小鼠脑中的分布形式，研究者采用激光共聚焦及免疫电镜-胶体金技术观察血脑屏障处星形胶质细胞终足处AQP4分布情况，激光共聚焦发现AQP4^A25Q/A25Q小鼠构成血脑屏障的星形胶质细胞终足处AQP4表达明显下降；胶体金免疫电镜同样显示AQP4^A25Q/A25Q小鼠中表达于星形胶质细胞终足处的AQP4胶体金颗粒明显减少，而星形胶质细胞其它部位胶体金颗粒较野生型小鼠明显增加。这表明A25Q突变导致星形胶质细胞终足处AQP4的表达显著降低（图3）。

图3  AQP4-A25Q突变降低了胶质细胞终足中AQP4的极化表达

（图源：Zhu DD, et al., J Neurosci, 2022）

前期研究显示AQP4敲除鼠显著降低各种因素引起的大脑星形胶质细胞终足水肿[7]。研究者为了评估AQP4-A25Q突变对脑水肿发生、发展的影响，首先采用急性水中毒诱导细胞性脑水肿这一种公认的脑水肿模型，通过小鼠的生存率、神经功能评分、脑水含量测定发现，AQP4-A25Q点突变能够改善水中毒小鼠脑水肿，并显著降低水中毒模型小鼠大脑星形胶质细胞及小胶质细胞激活。为一进步验证AQP4-OAP结构功能，研究者又采用另一种MCAO/R脑水肿模型，模拟人类缺血性脑卒中[8]。MCAO/R模型导致细胞和血管源性水肿，以及严重的脑损伤，并可能导致神经损伤甚至死亡[9]。通过对小鼠缺血2 h，再灌注24 h时检测小鼠生存率、神经功能评分、脑水含量、脑梗死体积大小以及神经元损伤情况进行分析，结果显示AQP4^A25Q/A25Q小鼠与AQP4^+/+鼠相比术后生存率更高，脑水含量更低，且脑梗死体积更小，神经元损伤较低（图4左），星形胶质细胞终足处水肿减轻。进一步通过免疫荧光观察星形胶质细胞及小胶质细胞激活情况，结果显示AQP4-A25Q点突变明显降低了MCAO/R模型小鼠星形胶质细胞激活及小胶质细胞激活（图4右）。这表明AQP4-A25Q点突变能够改善MCAO/R模型小鼠脑水肿及其继发的神经炎症反应。

图4   AQP4^A25Q/A25Q小鼠在MCAO/R后表现出脑水肿、神经功能恢复和存活率的改善、星形胶质细胞肿胀和活化减少

（图源：Zhu DD, et al., J Neurosci, 2022）

图5  工作总结图：脑水肿中AQP4-A25Q突变相关神经保护机制

（图源：Zhu DD, et al., J Neurosci, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

在正常情况下，构成血脑屏障的星形胶质细胞终足对于维持脑内离子和水的稳态发挥重要作用。在脑水肿时，AQP4将脑微血管内的水转运至星形胶质细胞，导致星形胶质细胞肿胀和激活。AQP4-A25Q点突变导致OAP结构解聚，进而降低星形胶质细胞终足处AQP4表达，从而减少水从脑微血管进入星形胶质细胞，降低星形胶质细胞水肿及激活，减轻神经元损伤（图5）。

综上所述，研究者所构建的AQP4-A25Q点突变小鼠导致AQP4 OAP结构解聚，但不影响AQP4蛋白的整体表达水平。A25Q点突变减少了AQP4在血脑屏障星形胶质细胞终足处的极性分布，并改变脑内星形胶质细胞的水运输特性，进一步证明AQP4 OAP的极化表达与脑缺血损伤时星形胶质细胞的水肿形成密切相关。因此，该研究可能为通过减少AQP4 OAP的形成来干预脑水肿提供新的视角。不足的是，AQP4存在多种亚型（如M1、M23、M1ex、AQP4e等），研究者并未观察不同AQP4亚型是否受到A25Q突变的影响。

原文链接：https://www.jneurosci.org/content/early/2022/09/09/JNEUROSCI.0401-22.2022

本文受辽宁省兴辽英才计划项目（XLYC1902044、XLYC1808031）、辽宁省重点研发计划项目（2019020048-JH2/103）、国家自然科学基金项目（81571061、U1908208、81671111）、辽宁省自然科学基金项目（2021-MS-280）资助。

李韶教授（左）、麻彤辉教授（右）

（照片提供自：李韶教授实验室）

往期文章精选
【1】Inflamm Regen︱吴安国/秦大莲/吴建明团队揭示苗药赶黄草活性单体改善阿尔兹海默症相关病理学【2】Transl Psychiatry︱网状荟萃分析：抗精神病药物所致高泌乳素血症的药物治疗策略【3】Nat Metab︱熊伟课题组阐明酒精和大麻协同导致运动毒性的新靶点【4】PloS Genet︱邢玲燕/吴刘成/孙俊杰合作揭示脊髓性肌萎缩症运动神经元非细胞自主变性新机制【5】Neuron︱突触内发动蛋白调控超快内吞方式的新分子机制【6】JNNP︱邱伟/余青芬团队在发现家族性视神经脊髓炎谱系疾病易感基因【7】Nat Neurosci︱突破！大脑电刺激可持续改善老年人的工作和长期记忆【8】Nat Methods︱张阳团队发布蛋白质/核酸及其复合物的通用结构比对算法：US-align【9】J Neuroinflammation 综述︱新冠肺炎与认知障碍：神经侵袭性和血脑屏障功能障碍【10】CRPS 综述︱沈国震团队评述光电人工突触器件研究进展优质科研培训课程推荐【1】R语言临床预测生物医学统计专题培训（10月15-16日，北京·中科院遗传与发育生物学研究所）【2】课程预告 | 神经干细胞如何高效培养？这次给你讲通透（2022年9月22日（周四）19:00-20:30）会议/论坛预告【1】课程预告 | 神经干细胞如何高效培养？这次给你讲通透（2022年9月22日（周四）19:00-20:30）【2】预告 | 神经调节与脑机接口会议（北京时间10月13-14日（U.S. Pacific Time：10月12-13日）欢迎加入“逻辑神经科学”【1】人才招聘︱“ 逻辑神经科学 ”诚聘文章解读/撰写岗位 ( 网络兼职, 在线办公)


参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Nielsen, S., et al., Specialized membrane domains for water transport in glial cells: high-resolution immunogold cytochemistry of aquaporin-4 in rat brain. J Neurosci, 1997. 17(1): p. 171-80.

[2] Papadopoulos, M.C. and A.S. Verkman, Aquaporin 4 and neuromyelitis optica.Lancet Neurol, 2012. 11(6): p. 535-44.

[3] Nagelhus, E.A. and O.P. Ottersen, Physiological roles of aquaporin-4 in brain.Physiol Rev, 2013. 93(4): p. 1543-62.

[4] Crane, J.M. and A.S. Verkman, Determinants of aquaporin-4 assembly in orthogonal arrays revealed by live-cell single-molecule fluorescence imaging.J Cell Sci, 2009. 122(Pt 6): p. 813-21.

[5] Smith, A.J., et al., Aggregation state determines the localization and function of M1- and M23-aquaporin-4 in astrocytes. J Cell Biol, 2014. 204(4): p. 559-73.

[6] Rosito, S., et al., Supramolecular aggregation of aquaporin-4 is different in muscle and brain: correlation with tissue susceptibility in neuromyelitis optica. J Cell Mol Med, 2018. 22(2): p. 1236-1246.

[7] Manley, G.T., et al., Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke. Nat Med, 2000. 6(2): p. 159-63.

[8] Hossmann, K.A., Experimental models for the investigation of brain ischemia.Cardiovasc Res, 1998. 39(1): p. 106-20.

[9]   Li, Q., et al., Inhibition of double-strand DNA-sensing cGAS ameliorates brain injury after ischemic stroke. EMBO Mol Med, 2020. 12(4): p. e11002.

本文完